Родился в небогатой дворянской семье Херсонской губернии.
Закончил гимназию с серебряной медалью.
Высшее образование получил на медицинском факультете Московского университета.
Работал в хирургическом отделение городской больницы г. Одессы.
В 1863 г. защитил в Харьковском университете докторскую диссертацию и отправился на два года в командировку за границу для «усовершенствования».
Стажируясь за рубежом, познакомился с известными западными врачами, а его выступления на европейских хирургических съездах вызывали у коллег живой интерес.
Участвовал в Австро-прусской войне, где активно работал в лазаретах и на перевязочных пунктах.
В 1871 г. приглашён на работу в Петербургскую Медико-хирургическую академию. Преподавал хирургическую патологию, заведуя одновременно хирургическим отделением военного госпиталя.
В 1876 г. вновь отправился на войну, на этот раз в Черногорию, в качестве консультанта по хирургии при Красном Кресте.
С 1878 г. возглавил хирургическую клинику баронета Якова Виллие.
В 1877-1878 гг. на Русско-турецкой войне, трудился хирургом на Шипке и под Плевной.
Полученный опыт военного хирурга изложил впоследствии в статьях Военно-медицинского журнала.
С 1880 г. на кафедре факультетской хирургической клиники, расположенной в Москве.
В 1893 г. вернулся в Петербург и занял место директора Клинического Елепинского института усовершенствования врачей, одновременно заведуя там хирургическим отделением.
В 1901 г. вышел в отставку и переехал в своё поместье Яковцы в Полтавской губернии, где и провёл последние годы жизни.
Склифосовский — автор 114 научных работ, отражающих новаторские идеи и личный опыт выдающегося врача и ставших ценным вкладом в сокровищницу мировой науки. Соредактор журнала "Хирургическая летопись" и соредактор и основатель "Летописи русской хирургии" и "Русского хирургического архива".
В 1929 г., за заслуги перед Отечеством, Советское правительство присвоило имя Склифосовского Московскому институту скорой помощи, основанному на базе одной из старейших столичных больниц — Шереметевской. В её стенах оказывалась помощь раненым во время Отечественной войны 1812 года, Русско-турецкой войны, Севастопольской кампании, Русско-японской войны, в дни восстания в Москве рабочих (декабрь 1905), Великой Отечественной войны 1941-1945 гг.
Институт считается преемником развития постулатов Склифосовского в сфере военно-полевой хирургии и в подготовке хирургов широкого профиля.
В 1970-х гг. на могиле Н. В. Склифосовского поставили памятник, на котором на русском и латинском языке высечена надпись: «Светя другим, сгораю сам».
13 апреля 2021 г. в Курске у главного корпуса Областной клинической больницы открыли памятник (бюст) Н.В. Склифосовскому. Автор — скульптор К. Кубышкин.